۲۹ مهر, ۱۳۹۸
به ایمونولوژی تودی، بزرگ ترین جامعه ایمونولوژی کشور خوش آمدید!

Western Blot

معرفی

وسترن بلات (که گاهی اوقات Protein Immunoblot نیز نامیده می شود)، به طور گسترده در رشته هایی مانند ایمونوژنتیک، بیولوژی مولکولی و سایر رشته های مولکولی استفاده می شود. از این تکنیک در جهت شناسایی پروتئین های بافت و نمونه های سلولی استفاده می شود.

به طور خلاصه، پس از دناتوره شدن پروتئین ها در نمونه، پروتئین ها بر روی ژل الکتروفورز قرار می گیرند. پس از آن آنتی بادی های اولیه برای اتصال اختصاصی به پروتئین ها اضافه می شود. پس از اضافه شدن آنتی بادی اولیه و شست شدن غشای الکتروفورز، آنتی بادی ثانویه کونژوگه به غشاء اضافه می شود. آنتی بادی ثانویه به دلیل اضافه شدن مولکول های کروموژن، رادیواکتیویته و یا .. که قابل شناسایی و ردگیری هستند، پروتئین های اختصاصی به صورت غیر مستقیم ردیابی می شوند.

نام وسترن بلات مشتق شده از نام تکنیک Southern Blot می باشد که برای شناسایی مولکول های DNA مورد استفاده قرار می‌گیرد و توسط Edwin Southern ابداع  شد. همچنین به تکنیک شناسایی مولکول های RNA نیز نام Northern Blot  اطلاق شد. نام وسترن بلات توسط W. Neal Burnette به این تکنیک داده شد. وسترن بلات همچنین از مرکز تحقیقات

Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research (FMI)، از بازال سوئیس  به دنیا معرفی شد.

در مورد FMI بیشتر بخوانید

کاربردها:

وسترن بلات به طور گسترده در بیوشیمی کاربرد دارد، و برای تشخیص کیفی پروتئین ها و همچنین تغییرات پروتئینی مورد استفاده قرار می گیرد. این روش برای تشخیص اختصاصی حضور یا عدم حضور پروتئینی خاص در یک ترکیب مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین از طریق سایز و شدت رنگ شکل گرفته بر روی غشای بلات می توان ارزیابی نیمه کیفی از پروتئین مورد نظر داشت. همچنین تهیه ی رقت سریالی از پروتئین خالصی که غلظت های آن را می دانیم می تواند در تعیین غلظت دقیق‌تر به کار آید.

وسترن بلات همچنین برای تأیید پروتئین تولید شده پس از کلونینگ مورد استفاده قرار می گیرد.

 

در تشخیص و آزمایشگاه

تأیید حضور ویروس HIV

تشخیص BSE یا همان بیماری جنون گاوی

 تشخیص تولارمی (تب خرگوش) که به دلیل باکتری فرانسیسلاتولرانسیس ایجاد می شود.

برخی از اشکال بیماری لایم (Lyme)

تأییدیه ی هپاتیت B

تأییدیه ی هرپس ویروس-۲ (HSV-2)

روش اجرا

در تکنیک وسترن بلات از ژل الکتروفورز برای جداسازی پروتئین ها بر اساس سایز و طول پروتئنی های دناتوره شده استفاده می گردد. پس از جداسازی پروتئین ها بر اساس سایز و طول رشته پلی پپتیدی، آن ها را به یک غشایی عمدتا نیتروسلولزی منتقل کرده و جهت مشاهده آن ها از روش های Immunostaining استفاده می کنیم. برای جداسازی پروتئین های دناتوره شده معمولا از SDS-PAGE استفاده می شود. از SDS به این دلیل استفاده می شود که به همه ی پروتئین ها بار منفی می دهد. هنگامی که همه ی پروتئین های نمونه دارای بار منفی شدند، مطمعن می شویم که تنها بر اساس سایز جداسازی انجام می شوند. پس از جداسازی پروتئین ها بر اساس سایز، پروتئین ها به یک غشای عمدتا نیتروسلولوزی، مرحله ی  Blocking جهت حذف اتصالات غیر اختصاصی انجام می شود. در مرحله بعد نمونه با آنتی بادی اختصاصی پروتئن هدف رنگ آمیزی می شود. نهایتا، غشا با آنتی بادی ثانویه که به آنتی بادی اولیه متصل می شود، رنگ آمیزی می شود. شناسایی آنتی بادی دوم می تواند توسط روش های مختلفی انجام بگیرد.

برای مشاهده کلیپ های این تکنیک، کلیک کنید.

 

IMMUNOLOGYTODAY

BETTER INTERACTION; BETTER LIFE


 

قالب خبری خوب ، طراحی و پشتیبانی تیم پرو استایل